2019-09-09 21:39:01
使用CRISPR/HDR进行基因组工程以使杂交瘤产生的抗体的功能多样化

使用CRISPR HDR进行基因组工程以使杂交瘤产生的抗体的功能多样化.jpg

生物工程师和生命科学家采用杂交瘤技术生产大量相同的抗体,并开发新的抗体治疗和诊断。最近关于该技术的临床前和临床研究强调了抗体同种型对治疗功效的重要性。在一项新的研究中,荷兰的一个研究小组开发了一种多功能的Clustered Regularly Interspaced Short Palindrome Repeats(CRISPR)和同源定向修复(HDR)平台,可以快速设计免疫球蛋白结构域并形成重组杂交瘤,分泌出首选形式的设计者抗体,物种或同种型。在该研究中,免疫学,蛋白质组学,免疫血液学,转化免疫学和肿瘤内科学的跨学科部门的Johan M. S. van der Schoot及其同事利用该平台形成重组杂交瘤,嵌合体和突变体。稳定的抗体产物保留了其抗原特异性。该研究团队认为,这个多功能平台将促进大规模抗体工程,为科学界提供临床前抗体研究的能力。这项工作现已发表在Science Advances上。

单克隆抗体(mAb)已经彻底改变了医学领域,应用于治疗曾经被认为无法治愈的疾病。自1975年以来,杂交瘤技术被广泛用于mAb发现,筛选和生产,作为可以为新的基于抗体的疗法产生大量mAb的永生细胞系。科学家在过去十年中为临床前研究生成,验证和促进了大量杂交瘤,其中mAb格式和同种型对于了解它们在临床前模型中的表现非常重要。基因工程mAb通常用重组技术生产,其中可变结构域应进行测序,克隆到质粒中并在瞬时系统中表达。这些过程耗时,具有挑战性且成本高昂,导致合同研究公司的外包工作,这妨碍了学术早期抗体开发和临床前研究的过程。

在其作用机制中,形成片段可结晶 - (Fc)结构域的恒定抗体结构域对于mAb的治疗功效是重要的,因为它们与特异性Fc受体(FcR)结合。先前的研究工作突出了Fc在基于抗体的疗法中的核心作用,以强调这一作用。自其问世以来,CRISPR和相关蛋白Cas-9(CRISPR-Cas9)靶向基因组编辑技术为基因治疗,免疫治疗和生物工程开辟了许多令人兴奋的机会。研究人员使用CRISPR-Cas9调节杂交瘤中的mAb表达,产生杂交瘤平台并设计杂交瘤以引入抗体修饰。然而,具有恒定结构域的杂交瘤中来自外来物种的通用和有效Fc取代的平台仍然需要进行基因工程改造。

在目前的工作中,van der Schoot等人。使用一步CRISPR /同源定向修复的基因工程杂交瘤。他们快速产生重组杂交瘤以分泌所选Fc形式的mAb,可自由安装优选的标签或插入突变。研究小组形成了产生片段抗原结合(Fab')的杂交瘤,即通常与抗原结合的抗体位点,C末端配备有用于位点特异性化学酶修饰和纯化的标签。他们产生杂交瘤以分泌具有所选同种型和种类的嵌合抗体,并形成Fc突变体抗体而不损害抗原特异性。他们容易地从杂交瘤上清液中分离出工程化抗体,以观察体外和体内预期的生化和免疫学特征。由于研究小组针对免疫球蛋白基因座的恒定结构域,因此CRISPR / HDR方法可以适应来自任何物种或同种型的杂交瘤。这种新的多功能抗体工程方法将为科学界提供临床前抗体研究。

Fab'片段先前用于治疗特定的自身免疫疾病,靶向不同的治疗性纳米医学有效载荷并产生双特异性抗体。在获得Fab'片段的常规技术中,科学家们无法在基因组中安装有用的标签或突变。为了在本研究中使用CRISPR / HDR获得Fab'分泌杂交瘤,研究小组选择杂交瘤克隆NLDC-145作为第一靶标,其分泌特定的目标mAb。为了靶向克隆的重链基因座,van der Schoot等。使用优化的指导RNA将Cas9蛋白导向感兴趣的铰链区并产生双链断裂。为了修复双链断裂,他们设计了HDR构建并插入了感兴趣的标签。由于HDR的功效通常较低,因此该团队丰富了含有供体构建体的细胞培养基的能力。然后,他们使用聚合酶链式反应(PCR)鉴定供体构建体的敲入,以确认供体构建体整合到正确的基因组位置。

一周后,他们获得单克隆细胞悬浮液并使用上清液测定分泌产物的抗原特异性和表型。他们使用流式细胞仪观察了大部分单克隆杂交瘤的成功基因工程,并通过蛋白质印迹分析验证了结果,以鉴定目标抗体产物/蛋白质。在成功形成重组杂交瘤以产生目的Fab'后,van der Schoot等。使用相同的策略开发免疫肿瘤学领域的其他感兴趣的杂交瘤。他们没有观察到使用CRISPR / HDR工程杂交瘤长时间(1至3年)抗体产生的下降。

受到一步法CRISPR / HDR策略成功生成Fab'杂交瘤的鼓舞,该团队继续通过设计杂交瘤来扩展该平台,以分泌相同抗体的多种Fc变体。作为概念验证,他们设计了CRISPR / HDR基因捕获敲入方法,并通过遗传工程杂交瘤MIH5对其进行测试以产生嵌合抗体。它们包括具有氨基酸取代的突变体同种型,他们使用基因组PCR评估靶向,敲入整合并验证预期PCR产物的存在。研究小组对纯化的嵌合抗体产物进行了蛋白质印迹分析,以确认在蛋白质水平上通过遗传引入的小鼠重链取代天然大鼠重链。他们表明使用CRISPR / HDR观察到的同种型修饰不仅限于MIH5杂交瘤。

在建立并验证杂交瘤CRISPR / HDR基因组工程方法后,该团队表征了同种型转换的mAb的功能或生物学特性。为此,他们进行了测量以确定抗体 - 受体相互作用。基于观察到的激活和抑制受体的能力,van der Schoot等。预测CRISPR工程化mAb引发抗体依赖性细胞毒性的能力 - 如先前研究中所观察到的。为了完成表征研究,研究小组测试了抗体在体外和体内诱导抗体依赖性细胞毒性的潜力。

对于实验室内实验,他们使用调理的小鼠结肠腺癌细胞(MC38)促进颗粒的吞噬/吞噬,MIH Fc变体与全血相互作用。对于体内实验,他们测试了MIH Fc变体消耗B细胞(产生免疫球蛋白)的能力。实验过程后,研究小组对小鼠实施安乐死并分离脾脏,以确定流式细胞仪和免疫荧光成像对B细胞的消耗。体内和体外测定均提供了类似的结果。总之,该工作表明使用CRISPR / HDR技术工程化的嵌合和突变mAb表现出与其天然和重组对应物相同的生物化学和免疫因子特征。

就这样,约翰M.S. van der Schoot及其同事开发了一个多功能平台,从其亲本杂交瘤开始,可以方便快速地生成Fc工程抗体。他们成功地使用一步法CRISPR / HDR方法获得杂交瘤,从而在21天内产生(1)单价Fab'片段,(2)来自外来物种的Fc同种型变体或(3)没有效应子功能的Fc沉默突变体。该方法包括用于纯化和位点特异性缀合的有用蛋白质标签。任何能够进行杂交瘤细胞系培养的实验室都可以使用该技术。

该过程提供了一种分子工具箱,可重新利用已建立的杂交瘤细胞系。在工作中开发的通用CRISPR / HDR平台具有100%的成功率;其中使用单一特异性HDR构建体的每个基因组工程实验产生多个正确工程化的杂交瘤克隆。由于杂交瘤产品主要用于体内临床前研究,因此该方法将为临床抗体研究提供治疗性抗体开发。工程化抗体产品的位点特异性功能化将在生物医学工程,化学生物学,药物开发和纳米医学领域具有广泛的应用,适用于整个科学界。

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