2019-07-30 10:06:02
微流体溶液中异源蛋白质的二维指纹图谱

微流体系统用于分子生物学,生物化学和生物技术,以快速分析具有高回收率和微小样品体积的异质生物分子混合物。然而,在单个设备中组合制备和分析过程以进行快速集成分析具有挑战性。在最近发表在Microsystems和Nanoengineering上的一项研究中,Kadi L. Saar及其在英国剑桥的化学,物理和流体分析有限公司的跨学科部门的同事开发了一种芯片,结合了两个准备和分析步骤。

最初,他们使用电压将蛋白质分子分离成通过常规上浆或拆分技术难以辨别的同等大小的生物分子的二元混合物。此后,研究小组使用新设备获得异源蛋白质混合物的二维指纹。该结果将为在短时间内获得生物分子系统的快速多参数数据开辟新的可能性。

由于样品要求非常低且回收率高,微流体技术对分析生物样品很有吸引力。平台可以在各个操作单元的水平上提供无法超越的分析速度,或者为多个单元提供直接组合的工作流程,而无需在单元之间进行样品转移。这种转移通过连接器或管道进行,并为样品引入分散,从而影响系统的性能。本文提出的工作流程可以分离异质混合物以确定感兴趣的组分并降低用于进一步处理混合物以进行纯化的复杂性。

研究人员之前已经引入了微米级的各种连续流动分子分离策略,包括自由流动电泳,介电电泳,磁泳和声泳分离。诸如激光或LED诱导荧光(LIF),化学发光或电化学方法的检测策略可以在这种微流体分离平台内并行地根深蒂固。分离化合物的分析信息可以通过质谱或SDS-PAGE等离线策略实现,但这些技术可能会限制单个设备的处理速度,导致样品丢失或污染。

萨尔等人。因此,在单个微流体装置中开发了完全整合的异质生物分子样品的分离和定量表征,以通过将芯片上分离直接耦合到芯片上分析和分子尺寸来克服现有限制。设计特征允许通过调整施加的场强来分析特定部分。他们设计该装置以识别类似于SEC-MALS(具有多角度光散射的尺寸排阻色谱法)或LC(芯片)-MS((片上) - 液相色谱 - 质谱法)方法的分离的级分。

该装置具有额外的好处,可以完全根据游离溶液中的电泳分离进行整个过程,使研究人员能够在几分钟内获得定量图,比传统技术快得多。混合物不受支持介质的影响,研究人员可以研究弱和非共价分子相互作用。

萨尔等人。使用连接到微流体扩散装置尺寸(MDS)单元的天然相定量电泳单元设计该装置。组合平台允许具有特定电泳迁移率(μe1)的组件用于片上下游分析,作为所施加的电场强度的函数。他们在电泳装置下游设计了三个通道,以便在不进入装置的情况下将电解产物保持在远离芯片的位置。它们最大限度地减少了驱动设备中流动的单个单元的数量,并与用于定量样品表征的稳定设备操作相结合。科学家们将电解液的出口与组合装置分开,以便在不产生电气短路的情况下在装置上施加电势,并且可以有效地去除任何电解产物而不会积聚以防止压力波动。

研究团队将电位应用于金属连接器,以根据同一团队设计的器件原型在芯片外部生成金属和流体界面。在这项工作中,萨尔等人。设计了一个Y形分流器,使流保持分开,直到它们到达分流器,以防止部分短路。他们计算了电解液进入器件的流速,从而影响器件性能。

总之,具有分离单元的微流体平台将一部分流体流引导至MDS单元,研究团队将其连接至分析SEC-MALS以识别离开分离模块的馏分。为了分析数据并获得每个分数的平均分子大小,他们使用数值求解器预测粒子分布的产生。萨尔等人。将预测的分布与实验数据进行比较,并提取每个部分中颗粒的流体动力学半径。

他们将样品与载体介质相遇的喷嘴成像为粒子运动的参考点。科学家调整了扩散的上浆通道或流速,以精确调整分析物分子的大小,大小的数量级更大或更小。由于他们使用聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)设计了微流体平台,科学家在分析图像数据之前消除了设置中的任何自发荧光。

然后他们使用该装置分析样品蛋白质的二元混合物;牛血清白蛋白和人溶菌酶。为了保留蛋白质分子的天然状态,他们使用自制的基于紫外波长的显微镜对无标记样品成像,并量化样品的内在荧光。萨尔等人。通过首先施加一组电压来记录荧光分布,证实了将混合物分离成其组分的能力。然后,他们记录了蛋白质的电泳迁移率(μe1)与装置中的流速相结合,以表征大多数蛋白质及其复合物。科学家改变了流速或施加的电压来分析具有不同生物物理参数的生物分子。

使用该平台,他们迅速表征了纳米级分子的混合物,其中各个分析物显示出相似的尺寸但具有不同的电泳特性。根据得到的直方图,研究小组确认存在两个不同的样本。相比之下,在片外常规分离方法中,后一步骤需要通过样品从一个分析工具转移到另一个分析工具通过互连管进行分馏,从而限制装置性能。研究中的总蛋白质浓度接近100μM,科学家们准确地检测到相对于蛋白质组分的固有荧光的灵敏度极限约为100 nM。对于光学非活性化合物,Saar等。提出了另一种检测和表征策略,如干质量传感。

萨尔等人。使用该策略获得蛋白质混合物的二维(2-D)特征图作为概念验证。他们从分离步骤中提取定量信息,并将应用的电位与物种的电泳迁移率相关联,以估计器件的功效。它们记录了在正常操作期间以及当分离室被短路时在系统中流动的电流以估计装置和电极的总电阻。

研究人员将电泳迁移率计算为粒子在电场中对每个分数的运动。基于实验数据,构建的2-D特征图包括混合物的有效电荷(q)和流体动力学半径(Rh)。得到的特定蛋白质的基本电荷单位与其他地方的估计值一致。他们通过仅监测单个成像帧来获得完整的二维图,以便快速进行溶液分析。

微流体装置从分离到扩散尺寸和成像的分析时间接近14秒。科学家在7分钟内仅使用3μL样品构建了实验2-D图,比传统2-D蛋白凝胶的时间尺度快了几个数量级。该研究团队在溶液中直接在原生条件下进行了广泛的生物分子相互作用,这些相互作用之前在实验室中具有挑战性。

通过这种方式,Kadi L. Saar及其同事开发了一种微流体装置,将片上分离与直接片上分析相结合,取代现有的传统微尺度方法。使用该装置,他们通过现有的溶液尺寸测量方法快速分析了无法识别为单个组分的蛋白质二元混合物。他们在快速时间尺度上构建了异质混合物的二维特征图,与现有的生物物理技术相比,以前所未有的时间分辨率开启了溶液中蛋白质表征的可能性。

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