2019-04-15 23:20:01
工程发夹提高了CRISPR准确度

杜克大学的生物医学工程师已经开发出一种方法,可以将CRISPR基因组编辑技术的准确性平均提高50倍。他们相信它可以很容易地转换为任何编辑技术不断扩展的格式。

该方法为引导RNA添加了短尾,其用于鉴定用于编辑的DNA序列。这种添加的尾部向后折叠并与其自身结合,形成“锁定”,只能被靶DNA序列解除。

该研究于4月15日在线发表在Nature Biotechnology杂志上。

“CRISPR通常具有令人难以置信的准确性,但有一些例子表明了脱靶活动,因此在整个领域对提高特异性有广泛的兴趣,”杜克大学生物医学工程鲁尼家族副教授Charles Gersbach说。 “但到目前为止提出的解决方案不能在不同的CRISPR系统之间轻松转换。”

CRISPR / Cas9是一种防御系统,细菌用于靶向和切割入侵病毒的DNA。虽然第一个被设计用于人体细胞的CRISPR技术源自一种名为化脓性链球菌的细菌,但更多的细菌物种带有其他形式。

该领域的科学家花了数年时间寻找具有所需特性的新CRISPR系统,并不断添加到CRISPR库中。例如,一些系统较小并且能够更好地适合病毒载体内部以递送至人细胞用于基因治疗。但无论他们的个人能力如何,所有人都有时会产生不必要的遗传编辑。

CRISPR系统的一个共同特性是它们使用RNA分子作为指导,其位于基因组中的靶DNA序列上。一旦指导RNA找到其互补的基因序列,Cas9酶就像剪刀一样在DNA中切割,促进基因组序列的改变。但是因为每个归巢序列只有20个核苷酸长,而人类基因组含有大约30亿个碱基对,所以需要排序很多,并且CRISPR有时会出现错误,序列中有一个或两个碱基对缺乏完美。

提高CRISPR准确性的一种方法是需要两个Cas9分子结合到相同DNA序列的相对侧上,以进行完全切割。虽然这种方法有效,但它会给系统增加更多部件,增加其复杂性并使其更难以交付。

另一种方法是对Cas9蛋白进行基因工程改造,使其不那么精力充沛,因此不太可能跳枪并犯错误。虽然这也显示出有希望的结果,但这种类型的蛋白质工程是费力的,并且这种努力对于每个CRISPR系统是特异性的。

“看起来几乎每周都会发现一种新的CRISPR系统,它具有某种独特的性质,使其对特定的应用非常有用,”Gersbach说。 “每当我们发现新的CRISPR蛋白质以使其更准确时,进行广泛的重新设计并不是一个简单的解决方案。”

“我们专注于一种不会添加更多部件的解决方案,并且对任何类型的CRISPR系统都是通用的,”Dewran Kocak博士说。在Gersbach实验室工作的学生领导了这个项目。 “所有CRISPR系统的共同点是指导RNA,这些短RNA更易于设计。”

Gersbach和Kocak的解决方案是将引导RNA延伸多达20个核苷酸,使其折叠回自身并结合到原始指导RNA的末端,形成发夹形状。如果在针对潜在切割进行仔细检查的DNA序列中即使单个碱基对不正确,也会产生一种非常难以置换的锁定。但是因为指导RNA更喜欢与DNA而不是自身结合,DNA的正确组合仍然能够打破锁定。

“我们能够对锁的强度进行微调,以便指导RNA在达到正确匹配时仍能正常工作,”Kocak说。

在该论文中,Kocak和Gersbach表明,这种方法可以将来自四种不同细菌菌株的五种不同CRISPR系统的人体细胞切割的准确性提高平均50倍。在一个案例中,改善上升到200多倍。

“这是一个非常简单的想法,尽管Dewran完成了数年的研究,表明它的工作方式与我们认为它的工作方式相同,”Gersbach说。 “这是一个很好的,优雅的解决方案,可以摆脱脱靶活动。”

展望未来,研究人员希望能够看到这种方法可以使用多少种不同的CRISPR变体,并完整地深入表征锁定机制如何工作以查看CRISPR变体之间是否存在差异。由于这些实验是在培养的细胞中进行的,研究人员迫切希望看到这种方法在实际动物疾病模型中如何提高CRISPR的准确性。

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