2019-04-11 22:48:01
片剂治疗(TOC)制造用于即时治疗的合成蛋白质

治疗性蛋白质是在实验室中生物工程化的基于蛋白质的候选药物,用于制药和临床应用。基于它们的药代动力学,候选物可分为以下组:(1)替代缺陷或异常蛋白质,(2)增强体内现有途径,(3)提供体内新功能或活性,(4)干扰分子或生物体的活性和(5)递送包封的蛋白质或化合物,包括细胞毒性药物,放射性核素或效应蛋白质。

在最近发表在Microsystems&Nanoengineering上的一项研究中,Travis W. Murphy和弗吉尼亚理工大学化学与生物系统工程系的同事开发了一种经济高效的即时护理蛋白质工程合成和纯化平台。他们在单一设置中构建了一个集成的微流体“片上治疗(TOC)”设备,用于无细胞,治疗性蛋白质合成和治疗性蛋白质纯化。

在护理点环境中合成治疗性蛋白质的能力可以在资源贫乏地区的全球分布期间快速降低储存和运输成本,并有助于节约科学的概念。目前大多数蛋白质使用细胞培养系统如重组大肠杆菌,酵母,哺乳动物细胞和植物细胞进行大规模生产,之后它们从集中式铸造厂全球分销。然而,这些合成蛋白质的有限半衰期需要低温储存和运输设施,这对生活在偏远和低资源地区的患者来说是具有挑战性的。

在目前的工作中,墨菲等人。首先通过表达和纯化报告蛋白 - 绿色荧光蛋白来证明该装置的工作原理。随后使用TOC生产天蚕素B  - 一种广泛用于控制生物膜疾病的抗菌肽。科学家成功合成并纯化了天蚕素B,在6小时内产生浓度为63 ng /μL,纯度为92%,然后通过生长抑制试验证实其抗菌性能。 TOC技术为即时临床治疗提供了即时蛋白质合成和纯化的新平台。

目前用于使用点蛋白质合成的最先进装置包括冰箱大小的系统,该系统跨越两天的生产 - 纯化循环以每天制造800剂量的药物。然而,与这种系统相关的资本成本在发展中国家是不可行的,在发展中国家,需要快速生产用于分配的质量治疗剂超过长期储存的大规模治疗剂生产。在Murphy等人开发的TOC系统中。科学家们利用无细胞蛋白质合成(CFPS)工艺完成了治疗蛋白质的即时合成和纯化。在该系统中,表达重组蛋白而不使用活细胞,适用于即时产生,其中冻干的起始材料在宽温度范围内储存期间可保持稳定。

在该研究中检测的蛋白质中,天蚕素B具有9.5ng /μL的最小抑制浓度以发挥抗微生物作用。利用微流体装置,科学家将蛋白质合成和纯化结合起来,以临床相关剂量(63 ng /μL)产生抗菌肽天蚕素B.设置中的连续流生产在三个开发阶段完成:

无细胞蛋白质合成(CFPS)反应器设计

净化反应器(P)设计

集成CFPS + P系统设计

墨菲等人。使用基于软光刻的聚二甲基硅氧烷(PMDS)成型来制造器件;使用微机械阀建造多层膜。

在CFPS反应器设备设计的第一阶段,科学家们制作了一个蛇形通道微流控芯片,类似于之前对片上蛋白质合成的研究。微流体装置包含连接到注射泵的入口,所述注射泵放置在显微镜的加热台上,其中三个入口接收(1)细胞裂解物,(2)CFPS反应缓冲液和(3)DNA模板进入长蛇形通道(近似130厘米)有一个插座。科学家以注射泵驱动的0.15μL/ min的组合流速喂养三种反应组分,停留时间为1.5小时。他们使用阶段加热器(37摄氏度)加热反应器,并使用COMSOL Multiphysics软件对设置进行建模,以验证设备机制,实现最佳的片上扩散混合和反应。为了验证设备的工作原理,Murphy等人。合成报告蛋白,GFP使用多种DNA模板。该系统在恒定的反应时间内产生大量蛋白质。

在第二阶段,墨菲等人。基于高效吸附和洗涤方案设计了一种用于蛋白质纯化的微流体装置,正如同一研究小组之前所证明的那样。他们使用电磁阀操作该装置以控制单个微机械阀和相关的振荡压力脉冲,以在四个主要步骤中执行蛋白质纯化。

在工作流程中,步骤是(1)珠子加载,(2)蛋白质吸附,(3)洗涤和(4)洗脱。为了优化这一过程,科学家将该方法划分为三种不同的工作流程。墨菲等人。然后改变了影响蛋白质纯化结果的条件,使产品纯度高达98.5%,产品收率为54.6%,优于其他方法。

在第三阶段,科学家开发了一个集成的微流体平台,无细胞蛋白质合成和纯化(CFPS + P)用于自动化。他们将连续流动反应器和批量纯化装置结合在一起,尽管这两个过程在开始时并不是本质上相互兼容的。为了实现足够的相容性,他们使用管储器将两个过程连接起来,所述管储器在纯化之前将连续产生的蛋白质储存在芯片上。在研究中用于操作微流体系统的所有装置可能适合公文包的尺寸,使其成为高度便携的治疗性蛋白质生产系统。

总的来说,完全整合的CFPS + P芯片包含五个主要步骤,包括引发,蛋白质合成,蛋白质吸附,洗涤和洗脱。在第六步,科学家们安排珠子清爽。墨菲等人。使用蛇形合成通道作为单独的合成模块,在合成所需量的蛋白质后,它们关闭来自纯化模块的装置以启动随后的纯化过程。为了测试设置的工作流程,科学家使用GFP并达到了98%的纯度。

在使用GFP进行CFPS + P工作流程优化后,科学家们使用相同的设置来优化合成天蚕素B的条件。通过设置中的表达,纯化,电泳和染色步骤,Murphy等人。确认天蚕素B的成功生产和纯化以及回收的可溶性蛋白质洗脱63 ng /μL,纯度为92%。然后,他们测试了天蚕素B相对于大肠杆菌抑制的生物活性,以通过抑制细菌生长来证明成功的抗生素活性。

以这种方式,使用微流体装置合成和纯化的治疗性蛋白质证明了活性和有效抑制细菌生长。经济高效的系统可以积极地集成在低资源环境中,以实现节俭科学。墨菲等人。打算在未来基于持续优化的基础上完全自动化系统。他们设想应用该设置来设计一系列不同的治疗蛋白质,以实现经济有效的护理点生产。

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