2019-03-26 21:38:01
使用miRacles进行细胞microRNA检测

微小RNA(miRNA)是短的非编码调节RNA,其可以在转录后抑制基因表达,因此越来越多地用作疾病的生物标志物。检测miRNA可能是艰巨且昂贵的,因为它们需要扩增,标记和放射性探针。最近发表于Science Advances的报告中,Arun Richard Chandrasekaran及纽约州立大学奥尔巴尼分校RNA研究所和生物科学系的同事报告了一步法,非酶microRNA检测使用构象无反应的DNA纳米开关进行测定。

科学家将该测定命名为“miRacles”,将缩写为“micro-RNA激活条件循环的工程开关”。该测定使用琼脂糖凝胶电泳读数证明了亚纳摩尔和单核苷酸特异性。在实验中,他们从纳克级别的分化肌肉中获得的RNA提取中检测到细胞微小RNA。科学家提出了一种经济有效的实验装置,可在数小时的时间内检测miRNA,为现有的定量聚合酶链反应(qPCR)和Northern印迹方法提供了一种令人信服的替代方法,以量化调控遗传物质。

miRNA可通过影响体内细胞增殖,分化和凋亡来调节正常生理发育和疾病期间的许多生物过程。 miRNA的表达可以在组织,细胞和体液中定量,作为细胞事件和疾病诊断的稳定生物标志物,突出了它们检测的重要性。然而,由于丰度低,体积小且序列相似,miRNA检测具有挑战性。生物分子占总RNA含量的约0.01%,并且每个细胞范围的单个mRNA拷贝可以广泛变化。另外,一个家族中的miRNA可以通过单个核苷酸而不同,而特定的miRNA可以在疾病和常规细胞功能期间受到调节。因此,检测miRNA的策略需要高特异性和正确鉴定来自富含主要RNA分子的样品中的少数分子的能力。

用于miRNA检测的传统方法包括Northern印迹,定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR),下一代测序和基于微阵列的杂交以将miRNA信号与噪声分离。在指定的方法中,Northern印迹可以直接识别天然miRNA,而其他方法依赖于额外的标记方法或逐步扩增,增加了检测的成本,复杂性和性能。例如,创新的DNA纳米结构可用于miRNA检测,其中各种研究小组先前已将纳米结构与纳米颗粒,杂交链反应和过渡金属二硫属化物纳米片组合以实现该过程。

在目前的工作中,Chandrasekaran等人。开发了一种相对简单的基于DNA的设备来解决复杂的生物医学挑战。在miRacles测定中,科学家使用由合理设计的DNA纳米开关组成的“智能试剂”,用于简单且经济有效的天然miRNA检测,无需在实验室中使用专用设备。 DNA纳米开关最初设计为用于单分子生物物理实验的工具,后来因其使用凝胶电泳检测和定量生物分子相互作用的能力而被认可。同一研究团队以前的合作研究工作集中在分子检测上,以量化蛋白质水平并检测合成DNA序列作为概念验证。

目前的工作扩展到初步研究和概念,以产生用户准备的多重miRNA检测和量化。科学家们使用普通实验室用品建立的实验装置,在短时间内分析了纳克细胞RNA提取物。他们将DNA纳米开关设计为线性双链体,在靶miRNA分子存在下形成环。为了构建纳米开关,Chandrasekaran等人。通过杂交与单链DNA支架互补的短寡核苷酸,使用DNA折纸方法。

他们设计了两条远处的“探测器”链,其突出部分与靶miRNA的不同区段互补。当miRNA识别并结合到构建体时,开关从线性“关闭”状态重新配置为环状“开启”状态。他们使用标准琼脂糖凝胶电泳来量化这两种状态,以检测由环状纳米开关产生的信号。信号仅通过感兴趣的单个miRNA扩增,结果与荧光共振能量转移(FRET)技术相比有利。

为了验证这一概念,研究人员团队选择了let-7b靶miRNA,因为其高度保守的家族有十几个相关的miRNA,这些miRNA因一个或多个核苷酸而异。这些miRNA由于其在生物功能中的关键作用和多种人类疾病的失调而适合。为了消除纳米开关和目标之间的串扰和噪声 - 与完美匹配相比导致信号强度降低,科学家们合理地重新设计了纳米开关。为了实现完美的特异性,它们使包含错配的一侧的相互作用不稳定。该研究的结果说明了由此开发的测定的高特异性,提供了miRNA检测中的关键挑战的答案,其以高信噪比达到高潮。

低丰度的miRNA也需要高灵敏度的检测,科学家通过优化方案实现了这一点。然后,他们对miRNA的另外两种变体(miR-15a和miR-206)进行了类似的实验,从而导致亚单体至单阿托莫尔水平的检测。例如,对于低浓度的目标样品(6pM),信号增加4小时,在该时间范围之外几乎没有变化。

miRNA通常也在细胞培养物,组织样品和体液中进行研究,并且易于加工以收集微克级的总RNA,以及小RNA的亚组分。为此,Chandrasekaran等人。使用成肌细胞作为肌肉分化的替代模型系统,以miR-206为主要靶标。在细胞培养期间,他们鉴定了分化骨骼肌中的miRNA,其中分子miR-206在晚期分化期间显着上调。当科学家收获未分化和分化的肌肉细胞以提取小RNA时,他们使用蛋白质印迹证实细胞分化,并分别对早期和晚期分化标志物myogenin(Myog)和肌球蛋白重链(MHC)进行免疫细胞化学。由于单个miRNA占总RNA质量的百万分之一水平,检测miRNA与在大海捞针中寻找针头一样具有挑战性。因此,为了验证生物检测的分析,Chandrasekaran等。从较不复杂的小RNA亚组分开始。其中使用miR-206靶纳米开关,科学家观察到未分化样品和分化1-4天的样品中小RNA中miR-206表达的逐渐增加。

由于多种mRNA也可以在不同的细胞或疾病阶段改变它们的表达,这种现象需要额外的检测能力。为了在实验装置中实现这一点,Chandrasekaran等人。使用纳米开关的可编程性并开发了能够检测来自相同样品的多种miRNA的多路复用系统。他们将检测器链置于DNA支架的所需位置,当与靶miRNA结合时产生不同大小的环。因此,纳米开关的环尺寸确定了凝胶迁移,从而在凝胶上产生独特的带以进行精确检测。在实验中,科学家选择了肌肉细胞中存在的4种miRNA; miR-206,miR-125b,miR-24和miR-133-3p以及阴性对照miRNA; miR-39特异于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)。

在50 ng的小RNA中,科学家们检测出了不同表达水平的4种miRNA,同时确认了阴性对照没有检测到。多重化策略允许科学家直接比较单个样品中的miRNA水平,无需标记或扩增。总的来说,这项工作为扩大miRacles测定的通量提供了额外的步骤。该功能可以扩展,以适应每个开关更多的miRNA。

通过这种方式,Chandrasekaran等人。从他们对合成DNA序列的初步概念验证检测中取得了实质性进展;用生物提取物建立,表征和优化即用型miRNA检测分析。所展示的工作是使用DNA纳米开关来检测来自真实生物样品的miRNA的第一个例子。虽然与其他常用技术相比,miRNA测定的性能具有竞争力,但是使用现有方法难以实现本工作中看到的1个核苷酸的选择性。 miRacles的敏感性也优于Northern印迹和微阵列。该测定可以在不需要扩增的情况下测量miRNA,具有更简单的方案并且没有额外样品处理的附加误差。该方案简单地将纳米开关与用于凝胶电泳的样品液混合,以在实验室中产生高质量的结果。该研究工作可能从生物样本转移到临床样本,以诊断和监测疾病。

更重要的是,目前的工作符合更广泛的节俭科学概念;具有成本效益的科学前景,已经为生物医学工程中的血液离心和水净化技术提供了低成本的解决方案。 Chandrasekaran等。通过破坏现有的成本/性能关系,通过混合读取智能试剂提供对简单miRNA检测方法的广泛访问,旨在继续为新兴的科学趋势做出贡献。

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